Perbezaan utama antara helicase dan topoisomerase adalah bahawa helicase adalah enzim yang memisahkan dua helai DNA pelengkap dengan memecahkan ikatan hidrogen antara pangkalan dua helai sementara topoisomerase adalah enzim yang menghilangkan lapisan super positif dan negatif yang terbentuk semasa proses melepaskan DNA dengan memotong dan menutup semula satu atau kedua helai dupleks DNA.
DNA adalah heliks berganda. Ia wujud dalam dua helai pelengkap yang diikat bersama melalui ikatan hidrogen. Replikasi DNA, transkripsi dan pembaikan DNA memerlukan dua helai dipisahkan antara satu sama lain untuk membuat salinan baru, membuat mRNA dan menambahkan nukleotida untuk diperbaiki. Dua enzim helicase dan topoisomerase mula berfungsi pada ketika ini. Oleh itu, kedua helikase dan topoisomerase sangat penting dalam penolakan DNA. Helicase memisahkan DNA untai dua menjadi helai tunggal dengan memutuskan ikatan hidrogen antara pasangan asas nukleotida dalam DNA untai dua. Sebaliknya, topoisomerase menguraikan sentuhan DNA dan melegakan sifat lapisan super DNA dengan memotong tulang belakang fosfat DNA sama ada dalam satu atau kedua helai.
