Perbezaan Utama - Blotting Utara vs Selatan vs Barat
Pengesanan urutan tertentu DNA, RNA, dan protein sangat penting untuk pelbagai jenis kajian dalam biologi Molekul. Elektroforesis gel adalah teknik yang memisahkan DNA, RNA, dan protein mengikut ukurannya. Dari profil gel, urutan DNA tertentu, urutan RNA, atau protein dikesan oleh teknik khas yang disebut pelekapan dan hibridisasi dengan probe berlabel. Terdapat tiga jenis kaedah blotting iaitu selatan, utara dan barat. Perbezaan utama antara penyebaran utara selatan dan barat terletak pada jenis molekul yang dikesannya dari sampel. Southern blotting adalah kaedah yang mengesan urutan DNA tertentu dari sampel DNA. Northern blotting adalah teknik yang mengesan urutan RNA tertentu dari sampel RNA. Western blotting adalah kaedah yang mengesan protein tertentu dari sampel protein.
KANDUNGAN
1. Gambaran Keseluruhan dan Perbezaan Utama
2. Apa itu Southern Blotting
3. Apa itu Northern Blotting
4. Apa itu Western Blotting
5. Side by Side Perbandingan - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Ringkasan
Apa itu Southern Blotting?
Teknik Southern blotting dikembangkan oleh EM Southern pada tahun 1975 untuk mengenal pasti urutan DNA tertentu dari sampel DNA. Ini adalah teknik blotting pertama yang diperkenalkan dalam biologi molekul. Ini memungkinkan pengesanan gen tertentu dari DNA, serpihan spesifik dari DNA, dan lain-lain. Terdapat beberapa langkah yang terlibat dalam teknik blotting selatan. Ia adalah seperti berikut.
- DNA diasingkan dari sampel dan dicerna dengan endonuklease sekatan.
- Sampel dicerna dipisahkan oleh elektroforesis gel Agarose.
- Serpihan DNA dalam gel didenaturasi menjadi helai tunggal dengan penggunaan larutan alkali.
- DNA helai tunggal dipindahkan ke membran penapis nitroselulosa dengan pemindahan kapilari.
- DNA yang dipindahkan terpaku pada membran secara kekal.
- DNA yang tetap pada membran dihibridisasi dengan probe berlabel.
- DNA yang tidak terikat dicuci dari membran dengan mencuci.
- Filem sinar-X terkena pada membran dan autoradiograf disediakan.
Southern blotting digunakan untuk pelbagai aspek biologi molekul. Ia berguna dalam pemetaan RFLP, kajian forensik, metilasi DNA dalam ekspresi gen, pengesanan gen bermutasi dalam gangguan genetik, cap jari DNA, dll.
Gambar 01: Teknik Southern Blotting
Apa itu Blotting Utara?
Northern blotting adalah kaedah yang dirancang untuk mengesan urutan RNA tertentu atau urutan mRNA dari sampel untuk mengkaji ekspresi gen. Teknik ini dikembangkan oleh Alwine, Kemp, dan Stark pada tahun 1979. Ia berbeza dengan teknik sourthern dan western blotting kerana beberapa langkah. Walau bagaimanapun, teknik ini juga dilakukan melalui elektroforesis gel, pembuangan, dan hibridisasi dengan probe dan pengesanan berlabel tertentu. Teknik blotting utara dilakukan seperti berikut.
- RNA diekstrak dari sampel dan dipisahkan dengan elektroforesis gel.
- RNA dipindahkan dari gel ke membran pelekapan dan diperbaiki.
- Membran dirawat dengan probe berlabel yang disiapkan dari cDNA atau RNA (probe itu melengkapi urutan tertentu dalam sampel).
- Probe diinkubasi dengan membran untuk mengikat dengan urutan tertentu.
- Probe tidak terikat dicuci.
- Fragmen hibridisasi dikesan oleh autoradiograph.
Northern blotting adalah alat penting dalam pengesanan dan pengukuran mRNA hibridisasi, mengkaji penurunan RNA, penilaian separuh hayat RNA, mengesan penyambungan RNA, mengkaji ekspresi gen, dll.
Gambar 02: Pencemaran Utara
Apa itu Western Blotting?
Western blotting adalah kaedah untuk mengesan protein tertentu dari campuran protein dengan penggunaan antibodi berlabel. Oleh itu, western blot juga dikenali sebagai imunoblot. Teknik ini diperkenalkan oleh Towbin et al pada tahun 1979 dan kini secara rutin dilakukan di makmal untuk analisis protein. Langkah-langkahnya adalah seperti berikut.
- Protein diekstrak dari sampel
- Protein dipisahkan mengikut ukurannya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida
- Molekul yang dipisahkan dipindahkan ke membran PVDF atau membran nitroselulosa melalui elektropori
- Membran disekat untuk mengikat bukan spesifik dengan antibodi
- Protein yang dipindahkan diikat dengan antibodi primer (antibodi berlabel enzim).
- Membran dibasuh untuk menghilangkan antibodi primer yang tidak terikat secara khusus
- Antibodi terikat dikesan dengan menambahkan substrat dan mengesan endapan berwarna yang terbentuk
Western blotting berguna dalam pengesanan antibodi anti-HIV dalam sampel serum manusia. Western blot juga dapat digunakan sebagai ujian pengesahan jangkitan Hepatitis B dan ujian pasti untuk penyakit sapi gila.
Gambar 03: Blotting Barat
Apakah perbezaan antara Southern Southern dan Western Blotting?
Artikel Diff Tengah sebelum Jadual
Blotting Utara vs Selatan vs Barat |
|
| Jenis Molekul Dikesan | |
| Pencemaran Utara | Blotting utara mengesan urutan RNA tertentu dari sampel RNA. |
| Pencemaran Selatan | Southern blotting mengesan urutan DNA tertentu dari sampel DNA. |
| Blotting Barat | Western blotting mengesan protein tertentu dari sampel protein. |
| Jenis Gel | |
| Pencemaran Utara | Ini menggunakan gel Agarose / formaldehid. |
| Pencemaran Selatan | Ini menggunakan gel Agarose. |
| Blotting Barat | Ini menggunakan gel Polyacrylamide. |
| Kaedah Blotting | |
| Pencemaran Utara | Ini adalah pemindahan kapilari. |
| Pencemaran Selatan | Ini adalah pemindahan kapilari. |
| Blotting Barat | Ini adalah pemindahan elektrik. |
| Probe Digunakan | |
| Pencemaran Utara | Probe cDNA atau RNA dilabelkan secara radioaktif atau bukan radioaktif. |
| Pencemaran Selatan | Probe DNA dilabelkan secara radioaktif atau bukan radioaktif. |
| Blotting Barat | Antibodi primer digunakan sebagai probe. |
| Sistem Pengesanan | |
| Pencemaran Utara | Ini dilakukan menggunakan autoradiograph, atau pengesanan perubahan cahaya atau warna. |
| Pencemaran Selatan | Ini dilakukan dengan menggunakan autoradiograph, pengesanan perubahan cahaya atau warna. |
| Blotting Barat | Ini dilakukan dengan menggunakan pengesanan perubahan cahaya atau warna. |
Ringkasan - Blotting Utara vs Selatan vs Barat
Blotting adalah teknik khas yang dikembangkan untuk mengenal pasti DNA, RNA atau protein tertentu dari sampel. Terdapat tiga prosedur pencucian berasingan, iaitu utara, selatan dan barat, untuk mengesan jenis molekul tertentu. Teknik Northern blotting dirancang untuk mengesan urutan RNA tertentu dari campuran RNA. Teknik Southern blotting memungkinkan pengesanan urutan DNA spesifik dari sampel DNA dan teknik western blotting dikembangkan untuk mengenal pasti protein tertentu dari campuran protein.
