Perbezaan Utama - Urutan Sanger vs Pyrosequencing
Penjujukan DNA sangat penting untuk analisis DNA kerana pengetahuan mengenai susunan nukleotida yang betul pada wilayah DNA tertentu mendedahkan banyak maklumat penting mengenainya. Terdapat kaedah penjujukan DNA yang berbeza. Penjujukan Sanger dan Pyrosequencing adalah dua kaedah penjujukan DNA yang berbeza yang digunakan secara meluas dalam Biologi Molekul. Perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan Pyrosequencing adalah bahawa penjujukan Sanger menggunakan dideoxynucleotides untuk menghentikan sintesis DNA untuk membaca urutan nukleotida sementara pyrosequencing mengesan pembebasan pirofosfat dengan memasukkan nukleotida dan mensintesis urutan pelengkap untuk membaca urutan tepat urutan.
KANDUNGAN
1. Gambaran Keseluruhan dan Perbezaan Utama
2. Apakah Urutan Sanger
3. Apa itu Pyrosequencing
4. Perbandingan Berdampingan - Urutan Sanger vs Pyrosequencing
5. Ringkasan
Apakah Penjujukan Sanger?
Penjujukan penjujukan adalah kaedah penjujukan DNA generasi pertama yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rakan-rakannya pada tahun 1977. Ia juga dikenali sebagai Jujukan Penghentian Rantai atau penjujukan Dideoxy kerana berdasarkan penghentian rantai oleh dideoxynucleotides (ddNTPs). Kaedah ini digunakan secara meluas selama lebih dari 30 tahun sehingga New Generation Sequencing (NGS) dikembangkan. Teknik penjujukan Sanger memungkinkan penemuan susunan nukleotida yang betul atau penyambungan serpihan DNA tertentu. Ia berdasarkan penggabungan selektif ddNTP dan penghentian sintesis DNA semasa replikasi DNA in vitro. Ketiadaan 3 'OH kumpulan untuk meneruskan pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida bersebelahan adalah ciri unik ddNTP. Oleh itu, setelah ddNTP dilampirkan, pemanjangan rantai berhenti dan berakhir dari saat itu. Terdapat empat ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP - digunakan dalam penjujukan Sanger. Nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA apabila dimasukkan ke dalam helai DNA yang semakin meningkat dan menghasilkan panjang DNA pendek yang berbeza-beza. Elektroforesis gel kapilari digunakan untuk mengatur helai DNA pendek ini mengikut ukurannya pada gel seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 01.
Rajah 1: Elektroforesis gel kapilari DNA pendek yang disintesis
Untuk replikasi DNA in vitro, hanya sedikit keperluan yang perlu disediakan. Mereka adalah enzim DNA polimerase, DNA templat, primer oligonukleotida, dan deoksinukleotida (dNTP). Dalam penjujukan Sanger, replikasi DNA dilakukan dalam empat tabung uji berasingan bersama dengan empat jenis ddNTP secara berasingan. Deoxynucleotides tidak diganti sepenuhnya oleh ddNTP masing-masing. Campuran dNTP tertentu (misalnya; dATP + ddATP) dimasukkan ke dalam tiub dan direplikasi. Empat produk tiub berasingan dijalankan pada gel di empat telaga yang berasingan. Kemudian dengan membaca gel, urutan dapat dibina seperti yang ditunjukkan pada Gambar 02.
Gambar 02: Penjujukan penjujukan
Penjujukan Sanger adalah teknik penting yang membantu dalam banyak bidang biologi molekul. Projek genom manusia berjaya diselesaikan dengan bantuan kaedah berdasarkan penjujukan Sanger. Penjujukan Sanger juga berguna dalam penjujukan DNA sasaran, penyelidikan penyakit kanser dan genetik, analisis ekspresi gen, pengenalan manusia, pengesanan patogen, penjujukan mikrob dll
Terdapat beberapa kelemahan penjujukan Sanger:
- Panjang DNA yang dijujukan tidak boleh lebih panjang daripada 1000 pasangan asas
- Hanya satu helai yang dapat dijujukan pada satu masa.
- Prosesnya memakan masa dan mahal.
Oleh itu, teknik penjujukan yang maju dikembangkan dengan masa untuk mengatasi masalah ini. Walau bagaimanapun, penjujukan Sanger masih digunakan kerana hasilnya yang sangat tepat sehingga sekitar 850 pecahan panjang pasangan asas.
Apa itu Pyrosequencing?
Pyrosequencing adalah teknik penjujukan DNA baru berdasarkan "penjujukan dengan sintesis". Teknik ini bergantung pada pengesanan pembebasan pirofosfat semasa penggabungan nukleotida. Proses ini digunakan oleh empat enzim yang berbeza: DNA polimer, ATP sulfurylase, luciferase dan apyrase dan dua substrat adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin.
Prosesnya dimulakan dengan pengikat primer dengan templat DNA sehelai helai dan polimerase DNA memulakan penggabungan nukleotida yang melengkapinya. Apabila nukleotida bergabung (polimerisasi asid nukleik), ia membebaskan kumpulan dan tenaga pirofosfat (dua kumpulan fosfat terikat bersama). Setiap penambahan nukleotida melepaskan kuantiti pirofosfat equimolar. Pirofosfat berubah menjadi ATP oleh ATP sulfurylase dengan adanya substrat APS. ATP yang dihasilkan mendorong penukaran luciferin yang dimediasi oleh luciferin menjadi oxyluciferin, menghasilkan cahaya yang kelihatan dalam jumlah yang sebanding dengan jumlah ATP. Cahaya dikesan oleh alat pengesan foton atau oleh photomultiplier dan membuat pirogram. Apyrase menurunkan ATP dan dNTP yang tidak digabungkan dalam campuran tindak balas. Penambahan dNTP dilakukan sekali gus. Oleh kerana penambahan nukleotida diketahui mengikut penggabungan dan pengesanan cahaya, urutan templat dapat ditentukan. Pyrogram digunakan untuk menghasilkan urutan nukleotida DNA sampel seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 03.
Pyrosequencing sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan penjujukan urutan DNA pendek. Ketepatan, fleksibiliti, kemudahan automasi dan pemprosesan selari yang tinggi adalah kelebihan pyrosequencing berbanding teknik penjujukan Sanger.
Gambar 03: Pyrosequencing
Apakah perbezaan antara Pengurutan Sanger dan Penguasaan Pyrosequencing?
Artikel Diff Tengah sebelum Jadual
Urutan Sanger vs Pyrosequencing |
|
| Penjujukan penjujukan adalah kaedah penjujukan DNA berdasarkan penggabungan selektif ddNTP oleh polimerase DNA dan penamatan rantai. | Pyrosequencing adalah kaedah penjujukan DNA berdasarkan pengesanan pelepasan pirofosfat setelah penggabungan nukleotida. |
| Penggunaan ddNTP | |
| ddNTP digunakan untuk menghentikan replikasi DNA | ddNTP tidak digunakan. |
| Enzim yang terlibat | |
| DNA polimerase digunakan. | Empat enzim digunakan: DNA polimerase, ATP sulfurylase, Luciferase dan Apyrase. |
| Substrat Yang Digunakan | |
| APS dan Luciferin tidak digunakan. | Adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin digunakan. |
| Suhu Maksimum | |
| Ini adalah proses yang perlahan. | Ini adalah proses yang pantas. |
Ringkasan - Urutan Sanger vs Pyrosequencing
Penjujukan penjujukan dan Pyrosequencing adalah dua kaedah penjujukan DNA yang digunakan dalam biologi molekul. Penjujukan penjujukan membina urutan nukleotida secara berurutan dengan menamatkan pemanjangan rantai sementara penjelasan pyrosequencing membina urutan nukleotida tepat mengikut urutan dengan memasukkan nukleotida dan mengesan pembebasan pirofosfat. Oleh itu, perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan Pyrosequencing adalah bahawa penjujukan Sanger berfungsi pada penjujukan dengan penamatan rantai sementara penguasaan pyrosequencing berfungsi pada penjujukan secara sintesis.
